Il était berger et, à l'âge de 15 ans, il est entré au noviciat des frères capucins à Morcone, en Italie, et a rejoint l'ordre à l'âge de 19 ans. Il a souffert de plusieurs problèmes de santé et, à un moment donné, sa famille a pensé qu'il était atteint de tuberculose. Il a été ordonné à l'âge de 22 ans, le 10 août 1910.

Alors qu'il priait devant une croix, il reçut les stigmates le 20 septembre 1918, devenant ainsi le premier prêtre à recevoir cette bénédiction. Au fur et à mesure que la nouvelle se répandait, surtout après que les soldats américains eurent rapporté des récits sur Padre Pio après la Seconde Guerre mondiale, le prêtre lui-même devint un point de pèlerinage pour les pieux et les curieux. Il recevait des confessions à l'heure. En 1956, il a fondé la Maison pour le soulagement de la souffrance, un hôpital qui accueille 60 000 personnes par an. Dans les années 1920, il a lancé une série de groupes de prière qui continuent aujourd'hui à compter plus de 400 000 membres dans le monde entier. Il est décédé le 23 septembre 1968 à San Giovanni Rotondo, Foggia, Italie, de causes naturelles.

Son miracle de canonisation concerne la guérison de Matteo Pio Colella, âgé de 7 ans, fils d'un médecin qui travaillait à la Maison pour le soulagement de la souffrance. Dans la nuit du 20 juin 2000, Matteo a été admis à l'unité de soins intensifs de l'hôpital pour une méningite. Au matin, les médecins avaient perdu tout espoir pour lui, car neuf de ses organes internes avaient cessé de donner des signes de vie. Cette nuit-là, au cours d'une veillée de prière à laquelle assistaient la mère de Matteo et quelques frères capucins du monastère de Padre Pio, l'état de l'enfant s'est soudainement amélioré. Lorsqu'il s'est réveillé du coma, Matteo a dit avoir vu un vieil homme à la barbe blanche et au long habit brun, qui lui a dit : "Ne t'inquiète pas, tu vas revenir : "Ne t'inquiète pas, tu seras bientôt guéri". Le miracle a été approuvé par la Congrégation et le Pape Saint Jean Paul II le 20 décembre 2001.